人類卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection， ICSI）技術(shù)開展至今已有30余年。其最初主要應用于針對嚴重少、弱、畸形精子癥導致的男性不育患者的治療，但隨著未成熟卵體外培養(yǎng)、卵子冷凍、胚胎植入前遺傳學檢測等輔助生殖技術(shù)的開展， ICSI使用比例已大幅提升。雖然目前ICSI技術(shù)相對成熟，但仍有很多細節(jié)值得關(guān)注和完善。為規(guī)范與優(yōu)化人類輔助生殖技術(shù)從業(yè)者的ICSI操作，由中國醫(yī)師協(xié)會生殖醫(yī)學專業(yè)委員會發(fā)起，并聯(lián)合全國多家生殖醫(yī)學中心共同編撰了本共識。
01 ICSI的適應證
01. 男性因素
① 極重度少精子癥及弱精子癥，即精子濃度<1×106/mL 及精子前向運動百分率<1%，處理后的前向運動精子總數(shù)不足 100 萬。
② 特殊類型畸形精子癥，如圓頭精子癥、大頭精子癥、無頭精子癥及精子鞭毛多發(fā)形態(tài)異常。
③ 精子功能異常。
④ 射精功能障礙。
⑤ 精子免疫性因素。
02. 非男性因素
① 需行 PGT 周期；
② IVM 周期；
③ 卵子凍融周期；
④ 不明原因前次常規(guī)IVF周期完全受精失??；
⑤ 前次周期卵子普遍存在透明帶異常。
應將ICSI作為上述男性與非男性因素的授精方式。對于常規(guī) IVF 授精有污染史且未能抗菌治愈的病例，仍然存在再次 IVF授精污染風險，可嘗試選擇ICSI。
02 ICSI周期中正常及常見異常形態(tài)卵子
通常情況下，僅對出現(xiàn)第一極體（Pb1）的核成熟卵子進行 ICSI 授精。本共識整理了正常及常見異常形態(tài)的卵子以作參考，詳見圖1。
注：COC示卵丘-卵母細胞復合物；Pb1示第一極體；ZP示透明帶；PVS示卵周間隙
圖1 人類正常及常見異常卵子
A示COC（成熟卵子，卵丘細胞松散，箭頭所示為Pb1）；B示COC（未成熟卵子，卵丘細胞致密，未見Pb1）；C示COC（退化卵子且透明帶破裂）；D示正常形態(tài)卵子；E示偏振光顯微鏡下正常形態(tài)卵子，紡錘體（箭頭所示）位于極體正下方；F示MⅠ卵子；G示GV卵子；H示胞質(zhì)粗糙，顆粒感明顯且均勻；I示胞質(zhì)可見滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)簇，光滑似圓盤；J示胞質(zhì)多發(fā)空泡（呈凹陷感，最大空泡直徑約16 μm，箭頭所示）；K示胞質(zhì)細胞器聚集，中央?yún)^(qū)域顆粒感明顯；L示異常ZP，呈瓊脂/蠟樣、無PVS、胞質(zhì)出現(xiàn)折光體（箭頭所示，約5 μm）；M示異常ZP，邊緣呈鋸齒狀，Pb1呈月牙狀（箭頭所示），無PVS；N示ZP增厚（>20 μm為增厚）；O示ZP著色，透明度下降（箭頭所示卵子）；P示PVS增大（至少可以容納2個正常大小的Pb1）；Q示ZP夾層（箭頭所示）；R示PVS內(nèi)大量顆粒碎片；S示巨大Pb1（長徑約80μm）；T示多Pb1且較大；U示Pb1碎片化且PVS增大；V示連體卵子；W示胞膜不規(guī)則；X示巨大卵子（箭頭所示，總體平均直徑約230 μm，胞質(zhì)平均直徑約150μm），雙Pb1，胞質(zhì)細胞器聚集；Y示長橢圓形巨大卵子；滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)簇（SERc）、大空泡（直徑>14 μm）或多發(fā)小空泡、胞質(zhì)細胞器聚集、鋸齒或蠟樣透明帶以及多重異常形態(tài)卵子會對受精、胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局產(chǎn)生較大的負面影響，但部分卵子通過ICSI仍然可以獲得健康活產(chǎn)嬰兒，因此建議這部分卵子進行特殊標記并不作為移植選擇。
03 卵子的顯微注射
01. 顯微操作系統(tǒng)
顯微操作系統(tǒng)應安置在百級凈化區(qū)域（ISO Class5），該區(qū)域應相對獨立、安靜且人員流動較小，遠離門口和傳遞窗口，盡量避免高效濾器出風口直吹操作臺面和操作人員，這樣可以保障操作環(huán)境穩(wěn)定，使操作人員免受外界因素干擾而更加專注。除此之外，與顯微操作相關(guān)的培養(yǎng)箱應盡量靠近顯微操作設(shè)備，增加操作流程的順暢度，減少配子或胚胎在外界暴露的時間。
02. ICSI操作皿的制備
ICSI操作皿各類微滴的具體布局沒有統(tǒng)一標準，可根據(jù)個人操作習慣制備，但應遵循如下基本原則及參考技巧：①操作液微滴應盡量集中于皿的中部，以避免操作針下降時觸碰皿的側(cè)壁；②如果是極重度少、弱精或睪丸/附睪精子，也可不用制作PVP微滴，直接將精子懸液制成微滴；③建議雙人制皿，及時覆蓋培養(yǎng)油，避免因揮發(fā)而改變液滴滲透壓。
03. 顯微操作針的安裝
① 安裝時避免注射針內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡；
② 操作針在插入持針器過程中如遇到較大阻力時切勿強行插入，應檢查持針器管路內(nèi)是否有破損的玻璃殘留物；
③ 若發(fā)現(xiàn)操作針吹吸不順暢，尤其是無法穩(wěn)定控制注射針內(nèi)的精子時，應首先檢查裝針位置和水晶螺母松緊度；當確保裝針到位并擰緊水晶螺母后上述問題仍未解決，應考慮是水晶螺母內(nèi)的密封膠墊出現(xiàn)了老化或破損，需及時進行更換；
④ 將安裝好的操作針在低倍物鏡（4×或10×）下進行調(diào)焦，并使注射針和持卵針成一條直線；
⑤ 注射針前端角度并非與皿底完全平行，但角度不宜過大，以成功壓停運動精子的最小角度為佳。
04. 卵子的脫顆粒
建議卵子在透明質(zhì)酸酶中作用的時間<30 s。脫顆粒的總時間控制在1~2 min內(nèi)，因此不建議一次操作過多的卵子（5~8 枚為宜）。建議使用口徑（內(nèi)徑）遞減的燒拉制成的玻璃吸管或商品化剝卵針逐步進行卵子脫顆粒：通常先用管口燒制光滑的巴斯德吸管在酶中進行吹吸消化、隨后用內(nèi)徑200 μm左右的吸管轉(zhuǎn)移至干凈配子緩沖液中、然后用內(nèi)徑 160~180 μm 的吸管/撥卵針進行“粗拆”、最后用內(nèi)徑 135~140 μm的吸管/撥卵針將顆粒細胞剝離干凈；脫顆粒后的卵子應進行充分洗滌，最后移入卵裂培養(yǎng)液中孵育至少1 h。
05. 顯微注射基本步驟
圖2 顯微注射過程（200×）
A示輕壓精子尾部中段或下段進行制動；B示調(diào)整 Pb1位置并固定卵子，針尖抵住透明帶后將精子移到針尖處；C示突破透明帶并刺入胞質(zhì)，但此時并未破膜；D示當胞質(zhì)瞬時流入針內(nèi)時（破膜），即刻終止負壓；E示精子進入胞質(zhì)，應避免注入PVP
將精子注入胞質(zhì)內(nèi)是受精的關(guān)鍵。精子頭頸部順利滑出針尖，并且撤針后不隨胞膜的回彈而持續(xù)后移，即標志著精子成功注入胞質(zhì)。當觀察到破膜成功，但精子在注入時明顯受阻而依然停留在針尖內(nèi)側(cè)，并且在撤針后精子會沿穿刺通道緩慢向外移動，表明回吐的胞膜“褶皺”阻礙了精子的進入。如遇此種情況，可以進行二次回吸胞質(zhì)，然后再重新注入精子；或者平行于第一次穿刺通道位置進行二次穿刺，重新破膜后再注入精子。經(jīng)過第一次穿刺拉伸后的胞膜，通常在二次穿刺時僅需輕微負壓甚至無需負壓即可破膜。推薦在200 ×~400 ×放大倍數(shù)下進行精子的制動和卵子的注射。
06. 精子的制動
對于精子的制動，成功阻止前向運動及尾部擺動即可；精子制動后盡快進行注射，不建議提前制動足夠數(shù)量的精子后再進行注射。對于極重度少精患者，為避免卵子外界暴露時間過長，可以提前抓取足夠數(shù)量的精子，但不提前進行制動。
07. ICSI 過程中極體擺放的位置
建議將 Pb1 置于 12 點或 6 點位置，于3點或9點位置（左手進針者）進行穿刺。使用顯微注射針輕壓卵子透明帶，使Pb1旋轉(zhuǎn)至穿刺焦距平面最清晰位置。
08. 注射針穿刺深度
建議穿刺深度為胞質(zhì)直徑的1/2~2/3為宜。但對于發(fā)生突然破膜（無穿刺漏斗形成）的卵子則不建議繼續(xù)進針，可直接將精子注入胞質(zhì)。
04 受精觀察
盡管有研究報道，通過 PGT 篩選正常雙親二倍體胚胎可以獲得健康嬰兒，但考慮到較低的正常胚胎率和較高的檢測成本，建議丟棄ICSI-1PN 來源的胚胎。ICSI-0PN 來源的胚胎可能是原核出現(xiàn)過早或過晚而錯過了觀察時間。鑒于高質(zhì)量 ICSI-0PN 來源的胚胎具有與 ICSI-2PN 來源胚胎近似的正常染色體發(fā)生率、雙親二倍體比例以及妊娠結(jié)局，建議對高質(zhì)量 ICSI-0PN來源胚胎行囊胚培養(yǎng)，形成可利用囊胚，經(jīng)充分知情同意后再行移植或冷凍保存。
05 ICSI特殊情況的應對及其他細節(jié)
01. 第一次減數(shù)分裂（MⅠ）
中期卵子的處理
對于卵子成熟率較低（<50%）或高齡（≥40歲）的患者，可對 MⅠ卵進行短時間的體外培養(yǎng)（取卵后8 h內(nèi)），從而增加卵子利用率及可用胚胎數(shù)量，但鑒于其較高的非整倍體率及不良妊娠結(jié)局，有條件的可酌情對形成的囊胚進行PGT-A檢測。
02. 易退化卵子的應對
脫顆粒過程中應避免高頻率、大幅度吹吸，剝卵針內(nèi)徑不應<135 μm；避免過度剝離顆粒細胞，殘余顆粒細胞不影響卵子的觀察和注射即可；當出現(xiàn)精子或胞質(zhì)黏針嚴重時，應及時更換ICSI針；ICSI針前端水平角度不宜過大；對于卵膜脆性較高的卵子，建議適當延長孵育時間，再行ICSI。
03. 無透明帶卵子的處理
圖3 人類無透明帶卵子行卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射及胚胎發(fā)育情況
A示固定卵子；B示穿刺胞膜；C示注入精子；D示第1天正常受精；E示第3天 8-細胞胚胎；F示第5天囊胚
ICSI過程中，Holding針負壓不宜過大，ICSI針刺入不宜過淺；由于觀察不到 Pb1，有條件的可以利用偏振光顯微鏡確認紡錘體位置后再行 ICSI；ZFOs 來源的卵裂期胚胎在移植或冷凍過程中容易發(fā)生解體，因此建議進行囊胚培養(yǎng)；為避免養(yǎng)囊換液過程中卵裂球分解，可以直接將培養(yǎng)微滴中的卵裂期培養(yǎng)液移除并重新注入囊胚培養(yǎng)液，或者使用一步培養(yǎng)液；建議對 ZFOs 進行單滴培養(yǎng)或應用時差成像系統(tǒng)進行培養(yǎng)。
04. ICSI完全受精失敗的應對
AOA 應謹慎應用，建議對前次 ICSI受精完全失敗或受精率低下的患者進行患者精子與供者卵子的交叉試驗、鼠卵激活試驗（MOAT）或精子的PLC ζ染色，來判斷
精源性或是卵源性O(shè)AD；可對Ⅰ型圓頭精子癥或精源性O(shè)AD的病例進行AOA治療；常用化學法激活劑包括離子霉素、A23187以及氯化鍶。三者之間的效果比較尚存爭議，但對于單獨應用上述3種激活劑臨床治療效果不佳的患者，可嘗試聯(lián)合應用。
05. 完全不活動精子的應對
ICSI過程中，將完全不活動精子中的活精子和死精子進行區(qū)分至關(guān)重要，因為死精子無法激活卵子而發(fā)生正常受精。常用的存活精子鑒別方法包括人工精子激活（ASA）、低滲膨脹試驗（HOST）、激光輔助不動精子選擇（LAISS）、精子尾部柔韌性測試（STFT）。
雖然上述四種方法存在各自的優(yōu)缺點，但IVF實驗室應至少采用其中一種用于不動精子的ICSI處理；鑒于ASA的安全性尚不明確，因此應謹慎應用；HOST和LAISS可以作為ASA無效病例的備選方法，但尚無證據(jù)表明兩者哪個更具優(yōu)勢，可以根據(jù)實驗室操作習慣及設(shè)備條件進行選擇應用；STFT方法通?？梢越Y(jié)合HOST和LAISS方法使用。
當使用 HOST時，精子在低滲液中暴露時間應少于 30 s。
06. 精子的優(yōu)選
目前還沒有可靠的技術(shù)可以徹底篩除 DNA 碎片化的精子，并且這些技術(shù)的安全性和有效性有待商榷，因此不建議將上述方法進行常規(guī)應用；對于精子DNA 碎片指數(shù)（DFI）>20%~30% 且具有不良預后因素（高齡、卵巢功能低下、反復種植失敗/流產(chǎn)）的病例可以嘗試上述方法進行精子的優(yōu)選，但由于相關(guān)研究缺乏前瞻性和隨機性，因此目前尚無法推薦好的精子優(yōu)選技術(shù)；若DFI持續(xù)較高且反復 ICSI 周期失敗2次以上可考慮從睪丸中獲取精子。
07. 其他細節(jié)
（1）卵子孵育、脫顆粒及ICSI時機的選擇：
取卵后 2~6 h 或人絨毛膜促性腺激素（hCG）扳機后 38~42 h 內(nèi)進行脫顆粒及 ICSI；建議脫顆粒后孵育 1 h再行ICSI；預后不良的患者可以利用紡錘體觀測儀評估卵子核-質(zhì)同步性，對于未見紡錘體的 MⅡ卵可以適當延后ICSI時間。
（2）PVP的濃度：
建議根據(jù)個人技術(shù)能力和習慣將PVP進行適當稀釋，5%的PVP是很好的選擇，一方面降低高濃度PVP對卵子發(fā)育潛力的負面影響，另一方面也幾乎不增加精子制動操作的時長。
（3）透明質(zhì)酸酶的濃度：
商品化透明質(zhì)酸酶（80 U/mL）可以直接應用。同時建議在不影響脫顆粒效果和時間的前提下可以進行稀釋應用。
質(zhì)控指標
根據(jù)2017年維也納共識及2018年中國胚胎實驗室關(guān)鍵指標質(zhì)控專家共識，將ICSI實驗室質(zhì)控指標的計算方式及標準歸納如下，詳見表1。
注：正常受精率和卵子退化率為關(guān)鍵質(zhì)控指標；1PN率為一般質(zhì)控指標；退化卵子定義為ICSI過程中出現(xiàn)胞質(zhì)崩解及受精觀察時發(fā)現(xiàn)凋亡的卵子；ICSI示卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射；PN示原核；Pb示極體
① 新人要充分了解ICSI的理論基礎(chǔ)及影響因素。只有熟練掌握撿卵、胚胎轉(zhuǎn)移、卵子脫顆粒等基礎(chǔ)技能的新人才可以開始訓練 ICSI 操作；
② 訓練期間可以使用未受精或廢棄的IVM卵子進行練習。當新人的平均每卵操作時間（從制動精子開始，至注射結(jié)束）與帶教胚胎學家相當、廢棄IVM 卵子受精率>60%、卵子退化率<10% 時，方可進行患者卵子的操作；
③ 新人在正式操作患者卵子初始階段，可以注射獲卵數(shù)較多患者（>10枚卵子）的部分卵子。至少注射 50 枚卵子后，當受精率及卵子退化率與胚胎學家注射的同批卵子結(jié)果相當時，方可進行獨立操作。
